젖소의 유방내로 병원성미생물이 침입하여 감염되면 유선조직의 염증상태로 인 하여 원유중에는 '체세포수'가 증가하게 된다. 이에 따라 체세포수를 측정하므로 서 유방염을 진단하는 기술은 전 세계적으로 가장 널리 이용되고 있다. 선진낙농 국가에서는 오래전부터 체세포수에 의한 유방염진단 및 등급제를 실시하고 있어 우유의 위생적인 측면에 높은 관심을 기울이고 있는 실정이다.
체세포수를 측정하는 방법으로는 직접염색에 의한 현미경적 검사법, 우유의 점 도를 이용하여 측정하는 Rolling Ball Viscometer(RBV)법, 체세포를 형광 물질인 에티디움 브로마이드(Ethidium bromide)로 염색시켜 계수하는 포소 매틱(Fossomatic) 및 소마카운터(Somacount), 코브라(Cobra)법이 있다.
우유중에 존재차는 체세포의 종류는 매우 다양하나 일반적으로 상피세포 (Epithelial Cell), 중성구(Neutrophils), 임파구(Lymphocytes), 단핵구 (Monocytes)와 그외의 세포 등을 들 수 있다. 건강한 유선으로 부터 분비되는 우유중엔 60∼70% 정도가 상피조직이지만 유방에 손상을 받게되면 중성구의 숫 자가 전체 세포수의 90∼95% 정도를 차지할 만큼 급증하게 된다. 따라서 체세 포수의 측정은 유선의 염증상태를 알아내는데 중요한 역할을 한다.
슬라이드 글라스의 1㎠내에 샘플우유 0.01ml를 도말, 건조시켜 염색후 현미 경하에 체세포수를 직접 검사하고 현미경계수를 곱하여 원유 1ml중 체세포수를 산정한다. 많은 시간과 노력이 들어서 다수의 샘플을 처리하기에는 부적합하다.
| MF | = | 100(우유희석배수) × 100(mm2을 cm2로 환산) | |
| r2(반지름) × 3.1416 | |||
| = | 10,000 | = 500,000 | |
| 0.082 × 3.1416 | |||
(한시야 면적은 r²×3.1416 이며, 1㎠를 현미경시야 면적으로 나누면 1㎠ 내의 현미경시야수가 되며, 이 수치에 우유희석배수를 곱하면 1ml 우유중의 현 미경계수츨 구할 수 있음)
체세포수 측정시 핵을 가진 모든 세포를 계산하고 핵이 없는 원형질 (cytoplasmic) 덩어리 및 작은 핵을 가진 작은 세포의 분해물(small cell fragment)은 계산하지 않는다. 체세포수의 산정은 <표 2>에서와 같이 working factor 를 곱하여 산정한다. 예를 들면 50시야를 임의로 측정했을 때 체세포수가 30이었다면 우유 1ml중의 체세포수는 working factor (10,000) × 측정수 (30) = 300,000 이 된다.
<표 2> 시야수와 working factor와의 관계
| 측정한 시야수 | Working factor |
| 1 | 500,000 |
| 10 | 50,000 |
| 25 | 20,000 |
| 50 | 10,000 |
| 100 | 5,000 |
| 200 | 2,500 |
체세포수 측정의 표준이 되는 검사법은 원유를 슬라이드에 직접 도말하여 검사 하는 직접현미경법이다. 그러나 이 방법은 각각의 원유를 사람이 직접 도말하고 염색하여 현미경으로 검사해야 하므로 번거로울뿐 아니라 많은 시간과 노력이 요 구되어서 등급별 유대를 지불하는 현행제도하에서 대량의 샘플을 검사하기에는 거의 불가능하며 비효율적이다. 따라서 현재 여러 낙농선진국가들에서는 표준용 액을 사용하여 직접현미경법을 기초로 보정을 한 자동화된 체세포 측정기기를 사 용하고 있는 실정이다. 이 기기들은 개발 당시의 조사결과 직접현미경법에 의한 체세포수와 비교했을때 95%이상의 상관관계가 있는 것으로 알려져 있기는 하 나, 현실적으고 여러가지 요인에 의해 변할 수 있기 때문에 체세포수 표준용액을 이용하여 정기적으로 이 기기들은 표준화해야 할 필요성이 있다.
이러한 필요성에 따라 선진 외국에서는 표준용액으로서 원유가 아닌 화학물질 (chemical bead류)을 이용하거나 원유에 보존제(Bronopol, Pottasium dichromate, Sodium Azide 등)만을 첨가하여 만든 표준용액을 사용하기도 하는데 그 유효기간이 7∼14일 정도 밖에 되지 않아 자주 만들어 써야만 하는 단점이 있다. 그리하여 수의과학연구소에서는 장기간 보존이 가능하며 체세포수 측정기기에 활용될 수 있는 원유의 체세포수 측정용 표준용액을 제공하고자 광범 위한 연구를 실시한 결과, 원유중의 체세포를 특수하게 고정처리하고 특정의 보 존제를 첨가함으고써 상기 목적을 달성할 수 있었다. 즉 포르말린(formalin) 10%(V/V) 및 증류수 90%(V/V)로 이루어진 고정처리액을 원유중에서 최종농 도가 0.25∼0.4%되게 처리하여 체세포를 고정시켰으며, 티머로살(thimerosal, 1%) 5∼15ml, 디메틸설폭시드(DMSO) 10∼20ml, 글리세린(glycerin) 10∼20ml 및 겐타마이신(gentamycin, 80mg/ml) 0.5∼2ml로 이루어진 보 존제 용액을 약 3%(V/V) 이상 함유하는 원유중의 체세포수 측정용 표준용액을 제조하였다. 위와 같은 방법으로 개발한 체세포수 표준용액은 종래의 표준 용액 에 비해 유효기간이 길며<표 3>, 현재 체세포수 표준측정법인 직접현미경법과 혈 액중 백혈구수 검사시 널리 사용되고 있는 혈구계산판을 이용하여 검사할 수도 있어, 표준용액의 정확성을 향상시킬수 있을 뿐만 아니라 체세포수 측정기기에 활용될 수 있는 등 여러가지 장점이 있다. 따라서 이렇게 제조된 표준용액은 체 세포수 측정기기 표준화를 이루는데 매우 중요한 지침이 될 뿐아니라 원유의 품 질향상과 더불어 유대지불 일원화에도 막대한 기여를 할 수 있을 것으로 생각된 다.
<표 3> 체세포수 표준용액의 보관온도에 따른 안정성(보존성) 결과
| 구분 | 체세포수(×1,000) | ||||||
| 검사전 | 7일 | 14일 | 24일 | 50일 | 60일 | 70일 | |
| 실온(25℃) | 302 | 306 (101.3) |
306 (101.3) |
241 (80.0) |
N.T | N.T | N.T |
| 702 | 699 (99.5) |
682 (97.1) |
519 (73.1) |
N.T | N.T | N.T | |
| 실온(25℃) | 302 | 304 (100.6) |
302 (100) |
299 (99.0) |
295 (97.6) |
301 (99.6) |
289 (95.6) |
| 702 | 707 (100.7) |
704 (100.2) |
700 (99.7) |
680 (96.8) |
691 (98.4) |
703 (100.1) |
|
* N.T : not test
** 결과 요약 : 보존성 시험결과 실온에서는 14일까지 안정성이 있고, 냉장보관상태에서는 70일 이상 안정성이 인정됨.
체세포수 측정장비 표준화 과정을 기술하면 다음과 같다. 먼저 제조된 표준용 액의 체세포수를 혈구계산법(Hematocytometer)과 직접현미경법으로 측정한 후 체세포수의 평균값과 표준편차를 구한뒤 표준편차가 5%이내에 있으면 이를 표준용액으로 사용하여 각 체세포 측정기기의 표준화 또는 보정(calibration) 을 실시한다. 기기별 보정 방법은 먼저 각 기기별로 영점을 확인한 다음 자동 보 정(automatic calibration) 프로그램에 들어가서 low, medium, high의 3 종의 표준용액을 40℃에서 5분간 가온한 후 체세포수를 측정하고 각 기기별 프 로그램에 맞게 보정을 실시하면 된다.
제조된 low, medium, high 3종의 표준용액에 대한 체세포 검사장비별 체 세포수를 측정한 결과치의 모든 검사 기기별 상관관계가 95%∼105% 이내인 값을 최종 체세포수 값으로 정한다<표 4>.
<표 4> 표준용액에 대한 체세포수 검사장비별 비교
| 측정방법 | 10회 평균 체세포수 (×1,000) | 비고 | ||
| Low | Medium | High | ||
| 직접현미경법 | 216(98.1) | 421(105) | 633(105) | 국립수의과학검역원 |
| Cobra | 216(98.1) 239(108) |
381(95.2) 388(97.0) |
570(95.0) 588(98.0) |
춘천가축위생시험소 전남가축위생시험소 |
| Foss 90 보정전(Gain:6.3, DL:3.05) 보정후(Gain:8.0, DL:2.0) |
202(91.8) 219(99.5) |
380(95.0) 407(101) |
588(98.0) 600(100) |
빙그레 도농집유장 |
| Foss 300 (slope:1,000, Bias:0) |
219(99.5) | 411(102) | 568(94.6) | 국립수의과학검역원 |
| Somacount (0.736) |
221(100) | 396(99.0) | 595(99.1) | 국립수의과학검역원 |
| 최종 조정값 | 220(100) | 400(100) | 600(100) | |
최종 조정된 3종의 표준용액과 실제 원유검사 결과와의 상관관계를 조사하기 위하여 먼저 체세포 검사기기별로 표준화를 실시한 다음 냉각기 원유에 대한 체 세포수값을 비교 조사하였다 그 결과 원유 위생등급과 관련이 있는 20만에서 75 만 범위에서는 기기별로 대부분이 90∼110%의 상관성을 나타내었다(표 5). 표 준용액에 비하여 원유검사시의 편차가 약간 더 큰 이유는 원유 자체가 여러가지 조건에 따라 쉽게 변할 수 있기 때문에 동일 샘플간의 결과도 5% 정도의 편차를 나타낼 뿐 아니라 또한 검사 기기별로 측정원리가 달라서 어느정도 차이가 있을 수 있기 때문인 것으로 생각된다. 하지만 체세포수 등급, 즉 1등급 20만 미만, 2 등급 20∼40만, 3등급 40∼75만, 등외 75만 이상의 등급 결정에는 5% 미만의 낮은 영향을 미치는 것으로 나타나서 크게 문제가 되지 않는 것으로 생각된다.
<표 5> 집합유에 대한 체세포수 * 비교
| Sample No. | 체세포수 (×1,000) | 상관관계(%) (Foss/Somacount) |
|
| Foss 300 | Somacount | ||
| 1 | 22 | 2 | 11 |
| 2 | 55 | 10 | 55 |
| 3 | 99 | 90 | 110 |
| 4 | 194 | 190 | 102 |
| 5 | 202 | 202 | 100 |
| 6 | 212 | 215 | 98.6 |
| 7 | 227 | 254 | 89.4 |
| 8 | 239 | 235 | 101 |
| 9 | 274 | 280 | 97.9 |
| 10 | 290 | 254 | 114 |
| 11 | 344 | 331 | 103 |
| 12 | 358 | 384 | 93.2 |
| 13 | 415 | 413 | 100 |
| 14 | 427 | 396 | 107 |
| 15 | 429 | 412 | 104 |
| 16 | 437 | 436 | 100 |
| 17 | 483 | 445 | 108 |
| 18 | 530 | 584 | 90.9 |
| 19 | 554 | 618 | 89.7 |
| 20 | 781 | 838 | 93.2 |
| 21 | 874 | 954 | 91.6 |
| 22 | 1,002 | 1,067 | 93.9 |
| 23 | 1,012 | 1,082 | 93.4 |
| 24 | 2,252 | 1,742 | 129 |
| 25 | 2,610 | 1,566 | 167 |
| 26 | 2,735 | 2,058 | 132 |
| 27 | 7,616 | 4,661 | 163 |
* 체세포수 표준용액으로 보정한 후 결과치 비교
위와같이 수의과학연구소에서 제조된 3종의 표준용액은 체세포수 검사장비에 대한 검증을 확인한 후 전국 각 시도 시험소 및 유업체 원유검사 담당자에 의해 서 체세포수 검사기기 보유기관으로 운송된다. 그리고 각 유업체 및 집유장 자체 검사원과 관할 가축위생시험소 원유검사 담당자 입회하에 기기를 표준용액으로 보정한다. 그 결과 포소매틱 90과 300, 그리고 소마카운터 기기간에 모두 95∼105% 전후의 높은 상관관계를 나타내었으며 체세포수를 보정할 수 없는 코브라에 대해서도 적용한 결과 현재 모두 표준용액과 비슷한 결과를 나타낸 것 으로 조사되었다.
한편 일부 체세포수 검사 장비가 표준용액과 상당한 차이를 보이는 것도 있었 는데, 이는 장비의 보수 및 관리상태가 적절하지 못한것 때문인 것으로 나타났 다. 이러한 장비들의 보수후 측정한 결과는 모두 정상치를 나타내었다. 또한 유 업체 원유자체검사원의 잦은 교체로 인하여 기기의 사용 및 관리가 제대로 되지 못한 경우도 있었다.
앞으로 이러한 부분들은 계속해서 확인 보완해야 할 것이며, 체세포 표준용액 을 이용한 정기적인 체세포 검사 결과의 일원화가 될 수 있도록 모두 최선을 다 해야 할 것으로 생각된다.